导读 迈迪安推出的Specimen-specific(TM) 针对特定样本类型的qPCR/LAMP预混液可用于从粗裂解物或富含抑制物的样本(如痰液、唾液、尿液、粪便或血液)中直接进行免核酸提取扩增，是使用于分子POCT的最佳选择。 PCR是一种化学酶反应，该反应中高效的DNA合成需要高效的DNA聚合酶活性以及其与核酸模板之间的良好相互作用（通过靶标变性和引物退火），这种相互作用涉及生化和生物物理过程。导致PCR反应效率低的原因有很多，当确认反应中其他组分没有问题的情况下，例如已添加了适当浓度的PCR试剂（引物、dNTP、MgCl2和Taq聚合酶），但PCR反应仍不理想，则很可能反应中存在抑制成分。  PCR反应中抑制物来源 PCR抑制物是一类异质性物质，是DNA模板量足够时扩增失败的最常见原因。 PCR抑制物来源包含内源性（来源于原始样本）或外源性（样本采集或核酸提取过程中引入）。 内源性抑制物 PCR抑制物存在于各种临床、食品和环境样本中。临床样本，如血液、血清或血浆、尿液和粪便，含有几种可能影响PCR扩增的物质。例如：  血液中存在的天然免疫球蛋白（IgG）是最主要的PCR抑制物之一，它对单链DNA具有特殊的亲和力。通过用非特异性DNA孵育样品可以中和IgG，部分消除这种抑制作用。  食品检测中，例如牛奶样本，所含的纤溶酶会降解Taq聚合酶，高钙浓度可能会抑制PCR。  植物样本携带许多抑制物质，例如多糖（e.g. 硫酸葡聚糖、木聚糖、硫酸葡聚糖和杜仲胶）会影响PCR效率。此外，浆果和西红柿中的酚类物质可能抑制RT-PCR反应。  土壤中可能含有腐殖酸和硫胺酸，即使是很低量的情况下也会抑制PCR。  污泥和废水中存在的脂肪、蛋白质、多酚和重金属、多糖、金属离子和核糖核酸酶----所有这些都是环境样本的常见PCR抑制物。 其他样本中常见的抑制物还包括细菌细胞的成分、非靶DNA和污染物，以及花粉、手套粉、实验室塑料制品和纤维素等实验室物品。 外源性抑制物 有效的细胞裂解或核酸提取中使用的几种物质在某些浓度下可能会抑制PCR反应，例如:盐（NaCl或KCl）、离子洗涤剂、非离子洗涤剂或有机分子（EDTA、乙醇、异丙醇或苯*酚）。 离子洗涤剂（如脱氧胆酸钠、沙可辛和SDS）对PCR具有高度抑制作用，而非离子洗涤剂（例如Nonidet P-40、Tween 20、Triton X-100和N-辛基葡萄糖苷）仅在相对较高的浓度下引起PCR抑制。 EDTA常存在于核酸提取试剂盒的洗脱缓冲液中，它是一种Mg离子螯合剂，因此在高浓度会抑制DNA聚合活性。苯*酚易使蛋白质变性，对酶有抑制作用，因此，须确保提取的核酸中不含苯*酚杂质。此外，多核酸提取试剂盒中的清洗缓冲液含有乙醇，也是一种强PCR抑制物，因此在洗脱DNA之前，让乙醇充分挥发至关重要。 有一些核酸提取方法建议氯化锂用于RNA脱盐，因为它比乙酸钠更易溶于乙醇。然而，要小心，因为它可以抑制蛋白质合成和DNA聚合酶。 PCR反应体系中常见的添加剂，如二硫苏糖醇、二甲基亚砜或巯基乙醇，在某些浓度下也可能具有抑制作用。此外，拭子的材料或运输介质的成分也可能影响PCR的灵敏度。 PCR抑制物的抑制原理 PCR反应性能的有效性可能受到不同抑制物在不同阶段干扰的影响。图1显示了主要的几种抑制原理： 1.抑制物结合核酸模板（图1A）：在核酸纯化过程中通过直接与单链或双链核酸结合而躲避清除。例如，核酸酶可以修饰或降解模板RNA或DNA，酚类可以在氧化条件下交联RNA，从而阻碍RNA分离。此外，多糖的存在可能会降低再悬浮沉淀RNA的能力。这些核酸提取的残留抑制物会与核酸结合而影响模板与聚合酶的结合。 2.抑制PCR反应中的辅助因子与聚合酶的结合（图1B）：例如高浓度的钙离子可能会与反应中的镁离子竞争性与DNA聚合酶结合；某些螯合剂，如单宁酸，会结合镁离子。这两种情况下，镁不再作为聚合酶的辅因子，因此酶活性被降低。 3.DNA聚合酶被抑制物降解、阻断或改变（图1B）：例如，反应中存在的蛋白酶或洗涤剂、尿素和苯*酚可以降解这种酶。钙、胶原蛋白、血红素和单宁酸可能会抑制聚合酶活性。黑色素与DNA聚合酶形成可逆复合物，多糖可能通过模仿核酸的结构来干扰酶过程。腐殖酸与模板DNA和聚合酶相互作用，因此即使在低浓度下也会阻止酶反应。 4.抑制引物与模板结合（图1C）：某些PCR抑制物可能会阻碍引物与DNA模板的退火，由于这种效应是由抑制剂与模板的竞争性结合引起的，可以通过适当的底物设计来克服这个问题，从而获得更高的熔点。 5.抑制逆转录酶（图1D）：某些抑制物通过直接与逆转录酶结合来抑制逆转录，导致其变性，或与DNA新生链结合，导致转录提前终止。例如，黑色素通过与酶的直接相互作用抑制逆转录。 6.干扰探针（图1E）：通过对荧光探针的干扰或增加背景荧光降低扩增效率。 图1.样品制备和PCR过程中PCR抑制作用。A）在核酸纯化过程中，抑制物与双链或单链核酸反应并共提纯; B）降低Mg2+和其他聚合酶辅因子的可用性，从而干扰DNA活性; C）干扰引物退火; D）与逆转录酶结合或与DNA链结合并终止它。E）阻止荧光团与新生DNA结合。 表1.常见的内源性和外源性PCR抑制物 PCR抑制物的去除 一般来说，可以通过使用适当的样品处理和核酸提取方法、选择更强大的DNA聚合酶或使用特定的PCR添加剂来降低PUC抑制物的影响。 1.降低核酸提取中的抑制物残留  稀释样品或提取的核酸，可同时降低模板中的PCR抑制物，这是一种简单的降低抑制的方法，但是缺点是由于稀释了模板，同时也有可能影响检测灵敏度。 2.通过选择更高效的DNA聚合酶 DNA聚合酶可以被生物样本中存在的各种化合物降解、变性或降低酶活性。针对检测样品选择合适的DNA酶或预混液，可以有效提高扩增效率，降低抑制作用。例如，Tth聚合酶（提取自嗜热栖热菌）和 Tfl聚合酶（提取自黄栖热杆菌）比常用的Taq聚合酶对血液的抵抗力要强。 通过定点突变工程化的Taq聚合酶，增强了对血液和土壤中抑制剂的抵抗力，并提高了对高浓度DNA结合染料的耐受性。例如，Taq聚合酶的突变体对引物模板具有更高的亲和力（突变体的Kd为1.1 nM，野生型Taq为102 nM）。 通过将DNA聚合酶融合到ssDNA结合结构域，也可提高对人类血液、乳铁蛋白和肝素的中的抑制物耐受性。 3.使用PCR增强剂 在PCR体系中，除了DNA聚合酶、引物、核苷酸和反应缓冲液（Tris-HCl、KCl和MgCl2）这些基础成分外，还需要许多增强剂提高扩增效率。通过增加或降低DNA模板的热稳定性、影响DNA聚合酶的错误率、影响系统特异性和增强对复杂生物样品中抑制物的耐受性增强不同条件下的扩增效率。例如： 蛋白质：最常用于促进扩增的两种蛋白质是BSA和单链DNA结合蛋白gp32，gp32是由噬菌体T4的基因32编码的蛋白质。BSA可以通过结合血红素、酚类、腐殖酸和钛酸等降低它们引起的PCR抑制作用。粪便样本中存在的蛋白酶对DNA聚合酶的降解会导致扩增抑制。BSA和gp32可作为蛋白酶的靶标来减轻这种抑制作用。 有机溶剂：DMSO和甲酰胺是两种经常用作PCR增强剂。它们都可能影响引物的热稳定性和DNA聚合酶的热活性，从而提高扩增的特异性。 非离子洗涤剂：例如Tween-20和Triton X，可刺激Taq DNA聚合酶的活性并减少酶的错误终止。 生物相容性溶质：例如甜菜碱和甘油，可增强蛋白质结构域之间的疏水相互作用和降低DNA的链分离温度来促进扩增。在扩增反应混合物中添加甜菜碱和甘油将有助于减少由富含GC的区域引起的二级结构的形成。 聚合物：例如PEG和葡聚糖，类似于有机溶剂的作用，PEG可以缓解粪便和植物多糖硫酸葡聚糖引起的抑制作用。 使用抗抑性缓冲液或预混液：PCR抑制物存在于各种样本中，可能会导致PCR灵敏度降低，甚至导致PCR结果假阴性。尽管提取核酸可以去除某些抑制物，但无法完全避免出现抑制物残留对PCR产生影响。因此，选用抗抑性的PCR反应缓冲液和预混液能有效降低PCR抑制物对反应的影响，提高检测的可靠性和灵敏度。 抗抑性PCR检测 不同的临床样本中含有的PCR抑制物不同，例如，血液中含有血红蛋白和免疫球蛋白G等，唾液中存在的黏蛋白和蛋白酶，尿液样本中存在的尿素，粪便样本中存在的胆酸盐等，植物中存在的多糖多酚等。 一般的抗抑性qPCR试剂对样本有普适性，但是可能对某种样本中的抑制物耐受性比较好，而对另一种样本中存在的抑制物耐受性一般，因此使用普通的抗抑性试剂很难对每种临床样本的直扩检测都能达到理想的灵敏度。 迈迪安推出的Specimen-specific(TM) 针对特定样本类型的qPCR/LAMP预混液可用于从粗裂解物或富含抑制物的样本(如痰液、唾液、尿液、粪便或血液)中直接进行免核酸提取扩增，是使用于分子POCT的最佳选择。 其独特的优化配方能专门针对不同类型样本中特有存在的抑制物有超高的耐受性，而同时还能达到超灵敏的检测，最低可以检测到个位拷贝数的DNA或RNA的。 迈迪安抗抑性qPCR预混液 （点击产品货号可查看详情） MDX013/016 抗抑性qPCR/RT-qPCR预混液 MDX092/121 可风干血液直扩qPCR/RT-qPCR预混液 MDX122/123 可冻干血液直扩qPCR/RT-qPCR预混液 MDX130/131 可风干唾液直扩qPCR/RT-qPCR预混液 MDX132/133 可冻干唾液直扩qPCR/RT-qPCR预混液 MDX140/141 可风干粪便直扩qPCR/RT-qPCR预混液 MDX142/143 可冻干粪便直扩qPCR/RT-qPCR预混液 MDX150/151 可风干尿液直扩qPCR/RT-qPCR预混液 MDX152/153 可冻干尿液直扩qPCR/RT-qPCR预混液   ↓现在赶紧联系我们订购样品吧↓进入-》迈迪安丁香通商铺 咨询详情订购样品： 电话：010-85660600 Meridian迈迪安官网：meridianbioscience.com/lifescience 邮箱：info.cn@meridianlifescience.com