“PacBio RS系统是NBACC测序项目的重大扩展，其长读长和通量灵活性为我们鉴定微生物病原体提供了很多新的选择。我们非常激动能在多个应用中率先使用它。”

Harold Swerdlow：

“过去我常常建议人们买什么样的测序仪合适，但现在我也开始纠结了。这完全决定于你想拿它干什么----市面上的测序仪都各有千秋，各有独门绝技。”

对于大的测序中心而言，只要新的测序技术出来，我们的反应就很直截了当，那就是“买下来赶紧试”。“我们倾向于测试绝大部分上市的测序仪，只要有理由相信新参数能带来一定程度的技术革新。”

“为了维持基因组学的前沿地位，我们探索基因组测序中的新机会。我们计划使用PacBio来改善病原体的de novo拼接，并提高一些物种的序列信息覆盖度，在未来，我们将通过甲基化位点的直接检测来探索表观遗传学。”

Eddy Rubin：

“我们的重点之一是de novo测序，用de novo测序的方法解析我们之前不了解的基因组，如宏基因组、真菌、植物等，长读长将是一个极大优势，因此PacBio对我们的确有帮助。”

“我们能够用Illumina更经济地开展多个应用，在多个长读长应用中我们将使用PacBio平台，在这之前我们使用罗氏454的测序技术，但现在我们希望能够用PacBio做之前454所做的许多事情。”

W. Richard McCombie：

“我们非常看重PacBio长读长在多个项目中的价值，这些项目包括了解人类基因组中的结构变异，以及植物基因组的de novo测序。”

Brewster Kingham：

“2011年9月我们投入安装了PacBio RS系统，我想，我们这的应该是全球第25台吧。我们用PacBio测病毒、细菌以及真核样品，我们也有一些基因组测序项目，比如用于海洋微生物的宏基因组。”

PacBio最适合的场合，主要在de novo测序或配合二代数据组装、碱基修饰直接识别、以及应用于靶向重测序中发现稀有突变、SNP、结构性变异（大片段插入或缺失）、单倍体型等等。“当然，我们的兴趣主要在宏基因组分析，单分子测序无需扩增，理论上就可以把环境中的任何微生物种群准确无误地鉴定出来。目前而言我们还是先从扩增开始，但我们正想往无需扩增的道路迈进。”

“C1和C2试剂我们都尝试过，C2太棒了，我敢说，和C1相比简直是‘白天与黑夜’的区别。”以前可能还有人对PacBio或者第三代测序持怀疑态度，C2的推出，可以在一定程度上逆转这样的逻辑。“我们用C2获得了4000 bp的平均读长，每个SMRT Cell的数据产出达到300 M，这比PacBio的官方数据还要好，我们没理由不满意。就连样品起始量也有所改进，比如我们现在可以尝试从500 ng做起。”

“错误率高？！我并不这么认为。起码我们的平均读长达到了4000 bp，以16S 核糖体扩增子测序为例，我们主要通过CCS环形比对测序模式，基因长度在600-700 bp，可以在单分子测序状态下实现4-6个Reads。覆盖度一提高，单分子的正确率就大大提高了。”还是同一个例子，我们测试的结果是，“2X覆盖对应的正确率为97%，3X为98%，如果采用5X以上，正确率就可以突破99%”。

“人们总是很喜欢拿第三代测序数据和第二代甚至第一代进行比较，但我认为，这实在不公平，三个阶段的数据类型完全不是一个概念。”你可以选择在Sanger、Illuminated和PacBio之间进行对比，甚至可以在每兆碱基多少费用的问题上纠缠不清。但不要忘了，我们从来不否认：Sanger法的超强精确性，尽管它目前是最昂贵的；Illumina是便宜，但读长太短，准确性也不比Sanger法高；PacBio可以将你引入单分子测序的境界，你的最大好处是可以获得4000 bp的平均读长，错误率总体看是随机的。“我只能说，任何东西都有缺陷，取决于你怎么去用好它。”

谈到测序费用，实际操作下来，对完成整个项目从测序、拼接、精细图、甚至到完整图，PacBio和Illumina结合起来的耗费最节约。

参考文献

1. Hybrid error correction and de novo assembly of single-molecule sequencing reads. Koren S, Schatz MC, Walenz BP, Martin J, Howard JT, Ganapathy G, Wang Z, Rasko DA, McCombie WR, Jarvis ED, Adam M Phillippy. Nat Biotechnol. 2012 Jul 1;30(7):693-700.

http://www.nature.com/nbt/journal/v30/n7/full/nbt.2280.html

2. Mind the Gap: Upgrading Genomes with Pacific Biosciences RS Long-Read Sequencing Technology. English AC, Richards S, Han Y, Wang M, Vee V, Qu J, Qin X, Muzny DM, Reid JG, Worley KC, Gibbs RA. PLoS One. 2012;7(11):e47768.

http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0047768

3. Origins of the E. coli strain causing an outbreak of hemolytic-uremic syndrome in Germany. Rasko DA, Webster DR, Sahl JW, Bashir A, Boisen N, Scheutz F, Paxinos EE, Sebra R, Chin CS, Iliopoulos D, Klammer A, Peluso P, Lee L, Kislyuk AO, Bullard J, Kasarskis A, Wang S, Eid J, Rank D, Redman JC, Steyert SR, Frimodt-M?ller J, Struve C, Petersen AM, Krogfelt KA, Nataro JP, Schadt EE, Waldor MK. N Engl J Med. 2011 Aug 25;365(8):709-17.

http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1106920

4. Pacific biosciences sequencing technology for genotyping and variation discovery in human data. Carneiro MO, Russ C, Ross MG, Gabriel SB, Nusbaum C, DePristo MA. BMC Genomics. 2012 Aug 5;13:375.

http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/375

参考影像
        1. PacBio AGBT 2012 Carneiro
        2. PacBio AGBT 2012 English
        3. PacBio AGBT 2012 Testimonial Carneiro
        4. Webinar: The Role of Adenine Methylation in Determining the Pathogenicity of a Bacteria, Eric Schadt (Mt. Sinai School of Medicine)
        5. Webinar: Mike Schatz (CSHL) - Error Correction and De Novo Assembly of Complex Genomes.

来源：生物通